Polymerase Chain Reaction

3 pages
48 views

Please download to get full document.

View again

of 3
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Share
Description
fghjnbvc
Transcript
   Polymerase Chain Reaction  (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secarain vitro (Reece 2004 : ! )# $eknik ini pertama kali dikem%an&kan oleh 'arr ullis pada tahun*+!# $eknik PCR dapat di&unakan untuk men&amplifikasi se&men DNA dalam ,umlah ,utaankali hana dalam %e%erapa ,am# Prinsip ker,a dari PCR adalah men&&andakan se&men DNAtertentu den&an memanfaatkan en-im se%a&ai pen&inisiasi replikasi (Roche dia&nostics 200. : *)# 'omponen / komponen reaction mixture  PCR aitu  DNA template  primer DNA polimerase  buffer   1 dapar dan dN$P# Pertama  DNA template # 3un&si  DNA template  di dalam proses PCR adalah se%a&ai cetakan untuk pem%entukan molekul DNA %aru an& sama#  DNAtemplate  ini dapat %erupa DNA kromosom DNA plasmid ataupun fra&men DNA apapun asalkandi dalam  DNA template  terse%ut men&andun& fra&men DNA tar&et an& ditu,u# Peniapan DNAtemplat untuk proses PCR dapat dilakukan den&an men&&unakan metode lisis sel ataupun den&ancara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid den&an men&&unakan metodestandar(Prome&a 202 : 2)# DNA an& dipakai dalam praktikum  Polymerase Chain Reaction   (PCR) an& dilakukan oleh praktikan aitu DNA kromosom larva udan& an& diisolasimen&&unakan teknik Wizard Genomic DNA Purification Kit. 'edua primer# Primer aitu suatu polimer asam nukleat pendek ( olionu!leotida ) an&mempunai urutan nukleotida an& komplementer den&an urutan nukleotida DNA templatdN$Ps (  Deoxynucleotide triphosphates ) %uffer PCR dan en-im DNA polimerase (Reece 2004:! )#Primer %erfun&si se%a&ai pem%atas fra&men DNA tar&et an& akan diamplifikasi dansekali&us menediakan &u&us hidroksi (56) pada u,un& 7 an& diperlukan untuk proseseksistensi DNA# Pemilihan primer an& tidak sesuai dapat mene%a%kan tidak ter,adina reaksi polimerasi antara &en tar&et den&an primer# $erdapat dua dua ,enis primer dalam suatu reaksiPCR aitu primer  re erse  dan  for#ard   an& %eker,a pada dua untai %er%eda (  sense  dan antisense )dalam satu DNA (Nicholl 2002: 2)#arat / sarat primer meliputi pan,an& primer kandun&an 8C dan meltin temperature #Pan,an& primer %erkisar antara + / 0 %asa# Primer den&an pan,an& kuran& dari + %asa akanmen,adikan spesifisitas primer rendah sehin&&a memun&kinkanter,adina misprimin. 'andun&an 8C an& ideal dalam primer adalah sekitar !09#  $eltin temperatur ( %m ) adalah temperatur di mana !0 9 untai &anda DNA terpisah# Pemilihan %m  suatu primer san&at pentin& karena %m  primer akan %erpen&aruh di dalam pemilihansuhu annealin  proses PCR# uhu optimalna %erkisar antara !0 0 C sampai .0 0 C# elain itu ,u&atidak %oleh ter,adi  self dimmer    pair    dimmer   atau hairpin (Roche dia&nostics 200. : 4) . 'eti&a DNA polimerase# Polimerase DNA merupakan en-im an& sta%il dalam pemanasan# mumna di&unakan en-im $a; DNA polimerase ($a; < %hermus a&uaticus )# =n-imini tetap sta%il men&amplifikasi DNA >alaupun amplifikasi %er,alan pada suhu mendekati titik didih air# Polimerase DNA %erfun&si se%a&ai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA# Pada prosesPCR en-im ini ,u&a diperlukan untuk tahap ekstensi DNA (Nicholl 2002: 24)#  'eempat buffer   1 dapar# 3un&si buffer   aitu untuk men,a&a keseim%an&an p6 medium#mumna buffer   PCR men&andun& sena>a &Cl 2 # &Cl 2  %ertindak se%a&ai kofaktor an& %erfun&si menstimulasi aktivitas DNA polimerase# &Cl 2  terse%ut ,u&a akan menin&katkaninteraksi primer den&an templat an& mem%entuk komplek larut den&an dN$P (sena>a antara)(6andoo ? Rudiretna 2000 : @)#'elima dN$P# dN$Ps merupakan suatu campuran an& terdiri atas dA$P( deo!siadenosin trifosfat  ) d$$P ( deo!sitimidin trifosfat  ) dC$P ( deo!sisitidin trifosfat  ) dan d8$P( deo!siuanosin trifosfat  )# dN$Ps %ertindak se%a&ai buildin bloc! DNA an& diperlukan dalam proses ekstensi DNA# dN$P akan menempel pada &u&us /56 pada u,un& 7 dari primer mem%entuk untai %aru an& komplementer den&an untai DNA template ('usuma 200 : 2)#iklus PCR meliputi ti&a tahap aitu denaturasi annealin' dan elon&asi# Pertamadenaturasi# ika larutan DNA dipanaskan maka ener&i termal akan memecahkan ikatan hidro&endan ikatan lain an& menentukan kesta%ilan heliks &anda aki%atna kedua untai akan memisahatau men&alami denaturasi# olekul DNA heliks tun&&al dari proses denaturasi cukup sta%il# ikasuhu diturunkan molekul terse%ut %iasana tidak men&alami renaturasi men,adi molekul DNAheliks &anda asal tetapi mem%entuk pola kusut namun untai an& salin& komplemen dapatmen&alami renaturasi secara perlahanlahan# ifat ini men,adi dasar teknik hi%ridisasi asamnukleat (oller 200. : 2.)#'edua annealin  # erupakan proses penempelan primer# $ahap annealin& primer merupakan tahap an& pentin& dalam PCR karena ,ika terdapat sedikit sa,a kesalahan pada tahapini maka akan mempen&aruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA an& diin&inkan# 3aktor an& mempen&aruhi tahap ini antara lain suhu annealin   dan primer#  Annealin   umumna %erlan&sun& pada suhu !4 o C (Ahlu>alia 2002 : + )#'eti&a elon&asi# etelah primer menempel pada untai DNA tar&et en-im DNA polimerase akan meman,an&kan sekali&us mem%entuk DNA an& %aru dari &a%un&an antara primer DNA cetakan dan nukleotida# ika dilakukan pen&ulan&an terhadap keti&a tahapanterse%ut maka untai DNA an& %aru di%entuk akan kem%ali men&alami proses denaturasi penempelan dan peman,an&an untai DNA men,adi untai DNA an& %aru# Pen&ulan&an prosesPCR akan men&hasilkan amplifikasi DNA cetakan %aru secara eksponensial (Billet 200.:  4)#ecara umum suhu annealin an& di&unakan aitu !4 0 C# Pemilihansuhu annealin   %erkaitan den&an %m  primer an& di&unakan untuk proses PCR#uhu annealin an& di&unakan dapat dihitun& %erdasarkan ( %m  / !) 0 C sampai den&an ( %m  !) 0 C# ecara teoritis %m  primer dapat dihitun& den&an men&&unakan rumus 2(A$)  4(C8)E(6andoo ? Rudretna 200. : 2 )# %hermal    Cycler merupakan suatu alat an& dapat men&atur suhu sesuai den&an urutan dan>aktu an& diin&inkan# aat melakukan metode PCR harus dilakukan kontrol positif an&diperlukan untuk men&etahui reaksi PCR %er,alan %aik atau tidak# elain itu ,u&a harus dilakukan  kontrol ne&atif untuk mence&ah kontaminasi pada PCR (6andoo ? Rudiretna 2000 : 2+)# $eknik PCR memiliki %e%erapa kele%ihan aitu reaksi san&at spesifik dan akurat mudah dilakukansecara otomatis dan >aktu relatif le%ih cepat dari teknik lain# 'ekuran&an dari PCR adalah %iaarelatif mahal rentan terkontaminasi dan tidak dapat men&ekspresikan mutasi (Futler 200!: +0 / +)# aat ini PCR sudah di&unakan secara luas untuk %er%a&ai macam ke%utuhan diantarana:Gsolasi DNA DNA se;uencin& forensik dan dia&nose penakit (Hein 20 : 4*)#
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks
SAVE OUR EARTH

We need your sign to support Project to invent "SMART AND CONTROLLABLE REFLECTIVE BALLOONS" to cover the Sun and Save Our Earth.

More details...

Sign Now!

We are very appreciated for your Prompt Action!

x